為確保產(chǎn)品的性能和無憂的操作，使用前請仔細閱讀本手冊，有任何疑問請咨詢本公司售后技術(shù)支持或當?shù)氐匿N售人員（聯(lián)系方式見附錄）。
1.產(chǎn)品介紹
TED Focurose FF是利用其螯合的金屬離子與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的某些氨基酸(主要為組氨酸、半胱氨酸、色氨酸)相互作用而進行分離純化，適用于His標簽蛋白及與金屬離子具有相互作用的生物分子的分離純化。強結(jié)合的金屬離子可以直接用于真核表達系統(tǒng)分泌表達的His標簽蛋白且耐受更高的還原劑、螯合劑，無需進行樣品前處理；介質(zhì)的清洗再生工作簡單，無需脫鎳直接進行NaOH清洗。
特點：
a.快速、簡單（一步純化）。
b.耐受更高的還原劑、螯合劑，真核分泌表達的His標簽蛋白無需前處理即可上樣，最大限度的保護蛋白活性。
c.無需脫鎳直接進行NaOH清洗，大大縮短了清洗周期。
d.多重選擇，可以螯合各種金屬離子進行使用（例如Ni2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Co2+、Ca2+等）。
備注：當螯合Ca2+時，避免使用磷酸鹽緩沖液（會形成沉淀）。
表1：TED Focurose FF性能參數(shù)
基質(zhì) | 高度交聯(lián)6%的瓊脂糖 |
粒徑范圍 | 45-165μm |
平均粒徑 | 90±5μm |
結(jié)合載量 | ≥10mg(His標簽蛋白)/ml(介質(zhì)) |
pH穩(wěn)定性 | 3-12（工作）2-14（清洗） |
化學穩(wěn)定性 | 0.01M鹽酸、0.01M氫氧化鈉（一周） 20mM EDTA、10mM DTT、1M氫氧化鈉、8M尿素、6M鹽酸胍(24小時) 100mM EDTA、0.5M 咪唑（2小時） 30% 異丙醇（20分鐘） |
兼容性 | 所有在Ni-6FF（IMAC）中正常使用的溶液 |
流速 | ≧300cm/h |
操作壓力 | ≤0.3MPa |
貯存溶液 | 20%乙醇 |
貯存溫度 | 4-30℃ |
2.螯合（以XK16/10為例）
2.1采用液滴對液滴（避免引入氣泡）的方式將柱子連接到層析系統(tǒng)上。
2.2用純化水以5ml/min的流速沖洗5個CV。
2.3用0.1M 金屬離子溶液以5ml/min的流速沖洗5個CV。
2.4用純化水以5ml/min的流速沖洗5個CV。
2.5用20%乙醇以5ml/min的流速沖洗5個CV。
3.溶液制備
平衡液：0.02M PB、0.5M NaCl、0.005-0.01M Imidazole，pH 7.4。
洗脫液：0.02M PB、0.5M NaCl、0.5M Imidazole，pH 7.4。
備注：當純化包涵體時，溶液中要添加8M Urea或6M Gua-HCl；包涵體變性后純化會出現(xiàn)結(jié)合力降低，從而導致不結(jié)合。
4.樣品制備
4.1樣品所在溶液要和平衡液保持一致，可以用平衡液進行裂解、透析/超濾/G25進行緩沖液置換。
4.2樣品過濾（平均粒徑<45μm，用0.22μm過濾；45μm<平均粒徑<165μm，用0.45μm過濾；平均粒徑>165μm，用 0.8μm過濾）。
5.純化流程（以XK16/10為例）
5.1采用液滴對液滴（避免引入氣泡）的方式將柱子連接到層析系統(tǒng)或蠕動泵或注射器上。
5.2用純化水以5ml/min的流速沖洗5個CV。
5.3用洗脫液以5ml/min的流速沖洗5個CV。
5.4用平衡液以5ml/min的流速沖洗10個CV。
5.5將樣品以5ml/min的流速上樣。
5.6用平衡液以5ml/min的流速沖洗至紫外吸收值平穩(wěn)（10-15個CV）。
5.7用洗脫液以5ml/min的流速洗脫5CV或20CV(階梯式洗脫5CV/線性梯度洗脫20CV)。
6.清洗（以XK16/10為例）
6.1 用純化水以5ml/min的流速沖洗5個CV。
6.2 用1.5M NaCl以5ml/min的流速沖洗10個CV。
6.3 用純化水以5ml/min的流速沖洗10個CV。
6.4 用1.0M NaOH以2.5ml/min的流速沖洗30個CV。
6.5 用平衡液以5ml/min的流速沖洗10個CV。
6.6 用純化水以5ml/min的流速沖洗10個CV。
6.7 用30%異丙醇以2.5ml/min的流速沖洗10個CV。
6.8 用純化水以5ml/min的流速沖洗5個CV。
6.9 用20%乙醇以5ml/min的流速沖洗5個CV。
7.常見問題
表2：常見問題及解決方案
問題 | 可能原因 | 解決方案 |
純化時目標物不與介質(zhì)結(jié)合 或結(jié)合量較低 | 1.上樣量過載 | 降低上樣量 |
2.上樣流速過快 | 降低上樣流速 | |
3.蛋白或脂類在介質(zhì)中聚集影響結(jié)合 | 及時有效地清洗介質(zhì)或更換新的介質(zhì) | |
4.表達條件過于劇烈,His標簽被包裹，不能與介質(zhì)結(jié)合 | 建議做一個空載體作為表達和純化的對照，確定表達條件是否合適 | |
5.初始樣品中沒有組氨酸標簽蛋白 | 通過基因序列或His標簽抗體核實 | |
6.目標蛋白出現(xiàn)在流穿中 | 目標蛋白沒有成功表達或樣品與平衡液中pH及組分不正確 | |
洗脫時沒有收集到目標物 或只收集到少量目標物 | 1.目標物沒有與介質(zhì)結(jié)合或結(jié)合量較少 | 先確認目標物是否與介質(zhì)結(jié)合 |
2.洗脫條件不合適 | 加大洗脫液中咪唑濃度 | |
3.洗脫時間不夠 | 降低流速，延長洗脫液的保留時間 | |
4.洗脫體積過小 | 加大洗脫體積 | |
5.洗雜時，目的蛋白被洗下來 | 降低洗雜液中的咪唑濃度 | |
6.目標物在洗脫液條件下出現(xiàn)聚集沉淀 | 檢測目標物在洗脫液條件（pH和鹽濃度）下的溶解度和穩(wěn)定性。可以嘗試在洗脫液中加入一些添加劑：如0.2% Triton X-100或0.5% Tween 20 | |
目標物純度較低
| 1.樣品沒有經(jīng)過前處理 | 樣品上柱前必須要經(jīng)過離心或過濾 |
2.樣品粘度過高 | 用平衡液適當?shù)南♂寴悠?，降低粘度?/span> | |
3.洗雜不徹底 | 加大洗雜體積直至基線平穩(wěn)并與平衡液一致 | |
4.雜質(zhì)蛋白或脂類在介質(zhì)中聚集沉淀 | 及時有效地清洗介質(zhì) | |
5.雜質(zhì)與Ni2+具有較高的親和力。 | 用其它類型介質(zhì)進行純化（如離子或分子篩） | |
6.目標物出現(xiàn)降解 | 檢測目標物的穩(wěn)定性并加入蛋白酶抑制劑 | |
7.柱料裝填效果不佳 | 重新裝填或購買 | |
8.雜質(zhì)與介質(zhì)出現(xiàn)非特異性吸附 | 適當選擇添加劑降低非特異性吸附,可以嘗試在樣品中加入一些添加劑：如0.5%Triton X-100、1.0% Tween 20或50%甘油 | |
9.分離柱頂部有較大儲樣體積 | 重新裝柱或降低儲樣體積 | |
10.介質(zhì)中有微生物生長 | 介質(zhì)使用完后，請及時正確保存介質(zhì) | |
介質(zhì)載量下降 | 1.上樣流速過快 | 降低上樣流速 |
2.蛋白或脂類在介質(zhì)中聚集，導致載量下降。 | 及時清洗介質(zhì) | |
3.使用次數(shù)過多 | 更換新介質(zhì) | |
4.表達條件過于劇烈,His標簽被包裹，不能較好與介質(zhì)結(jié)合 | 建議做一個空載體作為表達和純化的對照，確定表達條件是否合適 | |
色譜峰上升過陡 | 介質(zhì)裝填過緊 | 重新裝柱 |
色譜峰上升過緩或拖尾 | 介質(zhì)裝填太松 | 重新裝柱 |
柱床有裂縫或干涸 | 出現(xiàn)泄露或大體積氣泡引入 | 檢查管路是否有泄露或氣泡，重新裝柱 |
液流較慢 | 1.蛋白或脂類聚集 | 及時清洗介質(zhì)或濾膜 |
2.蛋白沉淀在介質(zhì)中 | 調(diào)整平衡液和洗脫液組分，以維持目標物的穩(wěn)定性和介質(zhì)的結(jié)合效率 | |
3.分離柱中微生物生長 | 所用試劑必須經(jīng)過過濾和脫氣； 樣品上柱前必須離心或過濾 |
8.訂購信息
表3：訂購信息表
產(chǎn)品 | 規(guī)格 | 貨號 |
TED Focurose FF | 25ml | HQ060310025M |
TED Focurose FF | 100ml | HQ060310100M |
TED Focurose FF | 500ml | HQ060310500M |
TED Focurose FF | 1L | HQ060310001L |
TED Focurose FF | 5L | HQ060310005L |
TED Focurose FF | 20L | HQ060310020L |
備注：大規(guī)格包裝產(chǎn)品或其它產(chǎn)品購買，請咨詢本公司當?shù)劁N售或售前技術(shù)支持。
地址：武漢市東湖開發(fā)區(qū)高新二路388號光谷國際生物醫(yī)藥企業(yè)加速器C11棟20層
電話：027-87772229
郵箱：huiyanbio@126.com
微信公眾號
匯研手機站
客服1
