膠原蛋白純化

案例介紹

膠原蛋白是由動物的成纖細胞合成的一種生物高分子，是一種白色、不透明、無支鏈的纖維型蛋白質，富含人體需要的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等氨基酸。

膠原蛋白具備高拉伸強度、生物降解性能、低細胞毒性等特性，并且作為創(chuàng)傷敷料時可促進細胞生長、促進細胞粘附，是一種適用范圍廣泛的生物醫(yī)用材料，目前已應用在敷料、人工器官再生醫(yī)學、組織工程、生物護膚等領域。

膠原蛋白的介紹

膠原蛋白的結構特征

膠原蛋白最普遍的結構特征是三螺旋結構，由三條a鏈多肽組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構型，三條相互獨立的膠原蛋白肽鏈依靠甘氨酸之間形成的氫鍵維系纏繞的結構，分子結構非常穩(wěn)定。

膠原蛋白的分類

膠原蛋白可分為動物膠原蛋白和重組膠原蛋白。動物膠原蛋白是利用膠原純化技術獲得具有天然膠原完整蛋白片段和三螺旋結構的膠原蛋白，在結構上保證膠原蛋白的生物學活性。動物膠原蛋白以牛、魚等動物提取制備，純化工藝難度較高。重組膠原蛋白，是基于基因重組技術，將人體中天然膠原蛋白的全長或部分基因，通過轉基因技術轉移至基因工程改造的真核或原核細胞中，再通過發(fā)酵培養(yǎng)等手段表達純化得到膠原蛋白。

膠原蛋白主流提取制備方法

目前市場上主流的膠原蛋白提取制備方法有兩種：基因重組法和動物源提取法。動物源提取法是指通過酸法、堿法、酶法等方式從動物肌腱、皮膚等組織中來提取膠原蛋白，過程可大致分為處理、溶出和純化3個步驟?；蛑亟M法是將人體膠原蛋白基因進行特定序列設計、酶切和拼接、連接載體后轉入工程細胞，通過發(fā)酵表達生產膠原蛋白?；蛑亟M法制備重組膠原蛋白主要包括表達體系的構建、發(fā)酵以及純化3個過程。

膠原蛋白純化應用案例

經過蛋白酶酶解過后，會得到多肽、多種氨基酸、小分子蛋白等復雜的混合物，需要通過分離純化技術得到高純度制品。在分離純化之前，首先需要了解分離純化的目的，產品純度和總回收率。另外，還需要了解目的蛋白的分子量、等電點、溶解性及穩(wěn)定性等基本性質，提取過程中需要保證蛋白質組成成分、結構性質和生物活性不發(fā)生改變。

線性洗脫

填料：Pheny Focurose HP

Buffer A: 20mM PB, 1.5M 硫酸鈉, 2mM EDTA, pH 7.0

上樣：樣品澄清過濾

Buffer B: 20mM PB, 100mM 硫酸鈉, 2mM EDTA, pH 7.0

洗脫方式：Buffer A 與0-100%Buffer B線性洗脫

樣品上樣后，目標蛋白和一部分雜蛋白可以與填料結合，不能與填料結合的雜質則會流穿出去，形成層析圖上的流穿峰，在該部分就可以起到一部分除雜效果；結合蛋白吸附在填料上等待后續(xù)洗脫。實驗初期不確定目標條帶會出現(xiàn)在何處，首先采用線性洗脫的方法，并結合電泳檢測確認雜質與目標條帶所處位置，從而進行精細純化。

由層析圖可見，線性洗脫過程中出現(xiàn)多個峰，分別對各峰進行電泳檢測，結合目標蛋白分子量大小以及電泳Marker條帶位置則可確定目標蛋白。

根據(jù)電泳結果顯示，E中存在目標蛋白，但目標蛋白中還存在雜質，需要進一步純化。后續(xù)可采取分步梯度的方法，將雜質與目標蛋白在不同的梯度中分開，并繼續(xù)用電泳檢測條帶純度。

梯度洗脫

填料：Pheny Focurose HP

Buffer A: 20mM PB, 1.5M 硫酸鈉, pH 7.0

上樣：樣品澄清過濾

Buffer B: 20mM PB, 100mM 硫酸鈉, pH 7.0

洗脫方式：Buffer A 分別與30%、70%、100%Buffer B分步梯度洗脫

在線性洗脫結果的基礎上進行優(yōu)化，確定洗脫梯度分別為30、70%、100%。由層析圖可見，經分步梯度洗脫后，可將線性洗脫中有重疊部分的峰完全分開。

經電泳檢測可見30%洗脫可將結合的不太牢的雜質先一步去除，70%洗脫中純化出純度高的目標條帶，100%洗脫可將其余結合較牢固的雜質全部去除。

由以上應用案例可見，經提取出來的蛋白存在很多雜質，純度很低，采用層析柱可對其進行純化。首先采用線性洗脫進行初步純化，結合電泳確定目標蛋白所在位置，此時目標蛋白與雜質未能徹底分開。在此結果上繼續(xù)優(yōu)化，采用梯度洗脫的方法將雜質與目標蛋白徹底分開，得到高純度的蛋白。

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關于我們

武漢匯研生物科技有限公司成立于2013年9月，是集生物大分子層析介質研發(fā)、生產、銷售于一體的高新技術企業(yè)。公司擁有大批高科技人才，在研發(fā)和創(chuàng)新能力方面投入了大量資金，擁有多項專利技術。通過獨特的凝膠微球表面改性技術，我們能夠生產凝膠、親和、離子、疏水、多模式等五大類100多種生物大分子層析介質產品，廣泛應用于疫苗、抗體、重組蛋白、基因治療等領域。在層析介質的基礎上，我們同時還提供特色的定制化填料開發(fā)服務和生物大分子純化工藝開發(fā)服務。      匯研生物目前已經成功實現(xiàn)了單條3000升瓊脂糖（多糖）微球生產線